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Os sistemas Lab-on-a-chip com capacidades no local oferecem o potencial para um diagnóstico rápido e preciso e são úteis em ambientes com recursos limitados, onde não estão disponíveis equipamentos biomédicos e profissionais treinados.No entanto, a criação de um sistema de testes no local de atendimento que tenha simultaneamente todos os recursos necessários para dispensação multifuncional, liberação sob demanda, desempenho confiável e armazenamento de reagentes a longo prazo continua sendo um grande desafio.Aqui descrevemos uma tecnologia de micro interruptor de deslocamento acionado por alavanca que pode manipular fluidos em qualquer direção, fornecer resposta precisa e proporcional à pressão de ar aplicada e permanecer estável contra movimentos repentinos e vibrações.Com base na tecnologia, também descrevemos o desenvolvimento de um sistema de reação em cadeia da polimerase que integra funções de introdução, mistura e reação de reagentes, tudo em um único processo, que alcança o desempenho de “amostra-resposta-saída” para todas as amostras clínicas nasais de 18 pacientes com Influenza e 18 controles individuais, em boa concordância de intensidade de fluorescência com reação em cadeia da polimerase padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Com base na tecnologia, também descrevemos o desenvolvimento de um sistema de reação em cadeia da polimerase que integra funções de introdução de reagentes, mistura e reação, tudo em um único processo, que alcança o desempenho de “amostra-resposta-saída” para todas as amostras clínicas nasais de 18 pacientes. com Influenza e 18 controles individuais, em boa concordância de intensidade de fluorescência com reação em cadeia da polimerase padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Verifique esta tecnologia, e também as descrições do sistema de polimento диняет функции введения реагентов, смешивания и реакции одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-от вет-выход» para sua clínica clínica trabalhando em cada 18 pacientes do Gripp e 18 controles adicionais, na área de trabalho, há uma configuração de polimerização padrão реакцией (коэффициенты Пирсона> 0,9).Com base nesta tecnologia, também descrevemos o desenvolvimento de um sistema de reação em cadeia da polimerase que combina as funções de injeção, mistura e reação em um único processo, permitindo amostragem em resposta para todas as amostras clínicas nasais de 18 pacientes com influenza.e 18 controles individuais, em boa concordância com a intensidade de fluorescência padrão da reação em cadeia da polimerase (coeficientes de Pearson > 0,9).Com base nesta tecnologia, também descrevemos o desenvolvimento de um sistema de reação em cadeia da polimerase que integra funções de injeção, mistura e reação de reagentes para analisar todas as amostras nasais clínicas de 18 amostras nasais de pacientes na amostra. Influenza e 18 controles individuais, intensidade de fluorescência compatível bem com reação em cadeia da polimerase padrão (coeficiente de Pearson > 0,9).A plataforma proposta garante a automação confiável da análise biomédica e, portanto, pode acelerar a comercialização de uma gama de dispositivos de teste no local de atendimento.
As doenças humanas emergentes, como a pandemia de COVID-19 de 2020, que ceifou a vida de milhões de pessoas, representam uma séria ameaça à saúde global e à civilização humana1.A detecção precoce, rápida e precisa de doenças é fundamental para controlar a propagação do vírus e melhorar os resultados do tratamento.Um ecossistema de diagnóstico central baseado em laboratórios centralizados onde as amostras de teste são enviadas para hospitais ou clínicas de diagnóstico e geridas por profissionais está atualmente a restringir o acesso de quase 5,8 mil milhões de pessoas em todo o mundo, especialmente aquelas que vivem em ambientes com recursos limitados.onde faltam equipamentos biomédicos caros e especialistas qualificados.médicos 2. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um sistema lab-on-a-chip barato e fácil de usar, com capacidade de teste no local de atendimento (POCT), que possa fornecer aos médicos informações diagnósticas oportunas para tomar decisões de diagnóstico informadas .e tratamento 3.
As diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) afirmam que um POCT ideal deve ser acessível, fácil de usar (fácil de usar com treinamento mínimo), preciso (evitar falsos negativos ou falsos positivos), rápido e confiável (fornecer boas propriedades de repetibilidade) e entregável (capaz de armazenamento a longo prazo e prontamente disponível para usuários finais)4.Para atender a esses requisitos, os sistemas POCT devem fornecer os seguintes recursos: dosagem versátil para reduzir a intervenção manual, liberação sob demanda para escalar o transporte de reagentes para resultados de testes precisos e desempenho confiável para suportar vibrações ambientais.Atualmente, o dispositivo POCT mais utilizado é a tira de fluxo lateral5,6 composta por diversas camadas de membranas porosas de nitrocelulose que empurram uma quantidade muito pequena de amostra para frente, reagindo com reagentes pré-imobilizados por força capilar.Embora tenham a vantagem de baixo custo, facilidade de uso e resultados rápidos, os dispositivos POCT baseados em tiras de fluxo só podem ser usados para testes biológicos (por exemplo, testes de glicose7,8 e testes de gravidez9,10) sem a necessidade de análises em vários estágios.reações (por exemplo, carregamento de múltiplos reagentes, mistura, multiplexação).Além disso, as forças motrizes que controlam o movimento do fluido (ou seja, forças capilares) não fornecem boa consistência, especialmente entre lotes, resultando em baixa reprodutibilidade11 e tornando as bandas de fluxo laterais úteis principalmente para uma boa detecção12,13.
A expansão das capacidades de fabricação em micro e nanoescala criou oportunidades para o desenvolvimento de dispositivos POCT microfluídicos para medições quantitativas .Ajustando as propriedades da interface 18, 19 e a geometria dos canais 20, 21, 22, a força capilar e a taxa de fluxo destes dispositivos podem ser controladas.No entanto, a sua fiabilidade, especialmente para líquidos altamente humedecidos, permanece inaceitável devido a imprecisões de fabrico, defeitos de material e sensibilidade a vibrações ambientais.Além disso, uma vez que é criado um fluxo capilar na interface líquido-gás, nenhum fluxo adicional pode ser introduzido, especialmente após o enchimento do canal microfluídico com líquido.Portanto, para uma detecção mais complexa, diversas etapas de injeção da amostra devem ser realizadas24,25.
Entre os dispositivos microfluídicos, os dispositivos microfluídicos centrífugos são atualmente uma das melhores soluções para POCT26,27.Seu mecanismo de acionamento é vantajoso porque a força motriz pode ser controlada ajustando a velocidade de rotação.No entanto, a desvantagem é que a força centrífuga é sempre direcionada para a borda externa do dispositivo, dificultando a implementação das reações em múltiplas etapas necessárias para análises mais complexas.Embora forças motrizes adicionais (por exemplo, capilares 28, 29 e muitos outros 30, 31, 32, 33, 34, 35) além da força centrífuga sejam introduzidas para dosagem multifuncional, transferências imprevistas de líquido ainda podem ocorrer porque essas forças adicionais são geralmente ordens de magnitude inferior à força centrífuga, tornando-os eficazes apenas em pequenas faixas de operação ou não disponíveis sob demanda com liberação de líquido.A incorporação de manipulações pneumáticas em microfluídica centrífuga, como métodos cinéticos centrífugos 36, 37, 38, métodos termopneumáticos 39 e métodos pneumáticos ativos 40, provou ser uma alternativa atraente.Com a abordagem contrafugodinâmica, uma cavidade adicional e microcanais de conexão são integrados ao dispositivo para ação externa e interna, embora sua eficiência de bombeamento (na faixa de 75% a 90%) seja altamente dependente do número de ciclos de bombeamento e da viscosidade do líquido.No método termopneumático, a membrana de látex e a câmara de transferência de fluido são projetadas especificamente para vedar ou reabrir a entrada quando o volume de ar retido é aquecido ou resfriado.No entanto, a configuração de aquecimento/resfriamento introduz problemas de resposta lenta e limita seu uso em ensaios termossensíveis (por exemplo, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)).Com uma abordagem pneumática ativa, a liberação sob demanda e o movimento para dentro são alcançados através da aplicação simultânea de pressão positiva e velocidades de rotação precisamente combinadas por motores de alta velocidade.Existem outras abordagens bem-sucedidas que utilizam apenas atuadores pneumáticos (pressão positiva 41, 42 ou pressão negativa 43) e projetos de válvula normalmente fechada.Ao aplicar pressão sucessivamente na câmara pneumática, o líquido é bombeado para frente peristálticamente, e a válvula normalmente fechada evita o refluxo do líquido devido ao peristaltismo, realizando assim operações complexas de líquido.No entanto, atualmente existe apenas um número limitado de tecnologias microfluídicas que podem realizar operações complexas de líquidos em um único dispositivo POCT, incluindo distribuição multifuncional, liberação sob demanda, desempenho confiável, armazenamento de longo prazo, manuseio de líquidos de alta viscosidade, e fabricação econômica.Tudo ao mesmo tempo.A falta de uma operação funcional em várias etapas também pode ser uma das razões pelas quais apenas alguns produtos POCT comerciais, como Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat e Rhonda, foram introduzidos com sucesso no mercado aberto até o momento.
Neste artigo, propomos um atuador microfluídico pneumático baseado na tecnologia de microinterruptores de anel verde (FAST).FAST combina todas as propriedades necessárias ao mesmo tempo para uma ampla gama de reagentes, de microlitros a mililitros.FAST consiste em membranas elásticas, alavancas e blocos.Sem a aplicação de pressão de ar, as membranas, alavancas e blocos podem ser hermeticamente fechados e o líquido em seu interior pode ser armazenado por muito tempo.Quando a pressão apropriada é aplicada e ajustada ao comprimento da alavanca, o diafragma se expande e empurra a alavanca para a posição aberta, permitindo a passagem do fluido.Isto permite a dosagem multifuncional de líquidos de forma em cascata, simultânea, sequencial ou seletiva.
Desenvolvemos um sistema de PCR usando FAST para gerar resultados de resposta em amostra para a detecção de vírus influenza A e B (IAV e IBV).Atingimos um limite inferior de detecção (LOD) de 102 cópias/mL, nosso ensaio multiplex mostrou especificidade para IAV e IBV e permitiu a patotipagem do vírus influenza.Os resultados dos testes clínicos utilizando amostras de esfregaço nasal de 18 pacientes e 18 indivíduos saudáveis mostram boa concordância na intensidade de fluorescência com RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Os resultados dos testes clínicos utilizando amostras de esfregaço nasal de 18 pacientes e 18 indivíduos saudáveis mostram boa concordância na intensidade de fluorescência com RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 pacientes e 18 здоровых лиц казывают хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Os resultados de ensaios clínicos utilizando amostra de swab nasal de 18 pacientes e 18 indivíduos saudáveis mostram boa concordância entre a intensidade de fluorescência do RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).0,9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 pacientes e 18 здоровых л e é possível que a solução seja mais eficiente do que o padrão ОТ-ПЦР она > 0,9).Os resultados de ensaios clínicos utilizando amostras de esfregaços nasais de 18 pacientes e 18 indivíduos saudáveis mostraram boa concordância entre a intensidade de fluorescência e o RT-PCR padrão (coeficiente de Pearson > 0,9).O custo estimado do material de um dispositivo FAST-POCT é de aproximadamente US$ 1 (Tabela Suplementar 1) e pode ser ainda mais reduzido usando métodos de fabricação em larga escala (por exemplo, moldagem por injeção).Na verdade, os dispositivos POCT baseados em FAST possuem todos os recursos necessários exigidos pela OMS e são compatíveis com novos métodos de testes bioquímicos, como ciclagem térmica de plasma44, imunoensaios sem amplificação45 e testes de funcionalização de nanocorpos46, que são a espinha dorsal dos sistemas POCT.possibilidade.
Na fig.1a mostra a estrutura da plataforma FAST-POCT, que consiste em quatro câmaras de líquidos: uma câmara de pré-armazenamento, uma câmara de mistura, uma câmara de reação e uma câmara de resíduos.A chave para o controle do fluxo de fluido é o design FAST (composto por membranas elásticas, alavancas e blocos) localizado na câmara de pré-armazenamento e na câmara de mistura.Como um método acionado pneumaticamente, o design FAST fornece controle preciso do fluxo de fluido, incluindo comutação fechada/aberta, dosagem versátil, liberação de fluido sob demanda, operação confiável (por exemplo, insensibilidade a vibrações ambientais) e armazenamento de longo prazo.A plataforma FAST-POCT consiste em quatro camadas: uma camada de suporte, uma camada de filme elástico, uma camada de filme plástico e uma camada de cobertura, conforme mostrado em uma visão ampliada na Fig. 1b (também mostrado em detalhes nas Figuras Suplementares S1 e S2 ).Todos os canais e câmaras de transporte de fluidos (como câmaras de pré-armazenamento e de reação) são incorporados em substratos de PLA (ácido polilático) que variam de 0,2 mm (parte mais fina) a 5 mm de espessura.O material do filme elástico é um PDMS de 300 µm de espessura que se expande facilmente quando a pressão do ar é aplicada devido à sua “espessura fina” e baixo módulo de elasticidade (cerca de 2,25 MPa47).A camada de filme de polietileno é feita de tereftalato de polietileno (PET) com espessura de 100 µm para proteger o filme elástico da deformação excessiva devido à pressão do ar.Correspondente às câmaras, a camada de substrato possui alavancas conectadas à camada de cobertura (feita de PLA) por dobradiças para controlar o fluxo de líquido.O filme elástico foi colado na camada de suporte com fita adesiva dupla face (ARseal 90880) e coberto com filme plástico.Três camadas foram montadas em um substrato usando um desenho de clipe em T na camada de cobertura.A braçadeira em T possui um espaço entre duas pernas.Quando o clipe foi inserido na ranhura, as duas pernas dobraram-se ligeiramente, depois retornaram ao seu estado original e amarraram firmemente a tampa e o suporte ao passarem pela ranhura (Fig. Suplementar S1).As quatro camadas são então montadas por meio de conectores.
Diagrama esquemático da plataforma ilustrando os vários compartimentos funcionais e recursos do FAST.b Diagrama ampliado da plataforma FAST-POCT.c Foto da plataforma ao lado de uma moeda de um quarto de dólar americano.
O mecanismo de funcionamento da plataforma FAST-POCT é mostrado na Figura 2. Os principais componentes são os blocos na camada base e as dobradiças na camada de cobertura, o que resulta em um desenho de interferência quando as quatro camadas são montadas em forma de T. .Quando nenhuma pressão de ar é aplicada (fig. 2a), o ajuste de interferência faz com que a dobradiça dobre e se deforme, e uma força de vedação é aplicada através da alavanca para pressionar o filme elástico contra o bloco, e o líquido na cavidade de vedação é definido como um estado selado.Deve-se notar que neste estado a alavanca está dobrada para fora, conforme mostrado na vista lateral da Fig.Quando o ar é fornecido (Fig. 2b), a membrana elástica se expande para fora em direção à tampa e empurra a alavanca para cima, abrindo assim um espaço entre a alavanca e o bloco para que o fluido flua para a próxima câmara, que é definida como um estado aberto .Após a liberação da pressão do ar, a alavanca pode retornar à sua posição original e permanecer firme devido à elasticidade da dobradiça.Vídeos dos movimentos da alavanca são apresentados no filme suplementar S1.
A. Diagrama esquemático e fotografias quando fechado.Na ausência de pressão, a alavanca pressiona a membrana contra o bloco e o líquido é vedado.b Em bom estado.Quando a pressão é aplicada, a membrana se expande e empurra a alavanca para cima, de modo que o canal se abre e o fluido pode fluir.c Determine o tamanho característico da pressão crítica.As dimensões características incluem o comprimento da alavanca (L), a distância entre o controle deslizante e a dobradiça (l) e a espessura da saliência da alavanca (t).Fs é a força de compactação no ponto de aceleração B. q é a carga uniformemente distribuída na alavanca.Tx* representa o torque desenvolvido pela alavanca articulada.A pressão crítica é a pressão necessária para levantar a alavanca e fazer o fluido fluir.d Resultados teóricos e experimentais da relação entre pressão crítica e tamanho do elemento.n = 6 experimentos independentes foram realizados e os dados são mostrados como ± desvio padrão.Os dados brutos são apresentados como arquivos de dados brutos.
Um modelo analítico baseado na teoria do feixe foi desenvolvido para analisar a dependência da pressão crítica Pc na qual a lacuna se abre nos parâmetros geométricos (por exemplo, L é o comprimento da alavanca, l é a distância entre o bloco e o dobradiça, S é a alavanca. A área de contato com o líquido t é a espessura da saliência da alavanca, conforme mostrado na Fig. 2c).Conforme detalhado nas Notas Suplementares e na Figura Suplementar S3, a lacuna se abre quando \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), onde Fs é o torque \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) para eliminar as forças associadas a um ajuste de interferência e fazer com que a dobradiça dobre.A resposta experimental e o modelo analítico apresentam boa concordância (Fig. 2d), mostrando que a pressão crítica Pc aumenta com o aumento de t/le diminuição de L, o que é facilmente explicado pelo modelo de feixe clássico, ou seja, o torque aumenta com t/Lift .Assim, nossa análise teórica mostra claramente que a pressão crítica pode ser efetivamente controlada ajustando o comprimento da alavanca L e a relação t/l, o que fornece uma base importante para o projeto da plataforma FAST-POCT.
A plataforma FAST-POCT fornece distribuição multifuncional (mostrada na Figura 3a com inserção e experimento), que é a característica mais importante do POCT bem-sucedido, onde os fluidos podem fluir em qualquer direção e em qualquer ordem (cascata, simultâneo, sequencial) ou multicanal seletivo dispensando.– função de dosagem.Na fig.3a(i) mostra um modo de dosagem em cascata no qual duas ou mais câmaras são colocadas em cascata usando blocos para separar os vários reagentes e uma alavanca para controlar os estados aberto e fechado.Quando a pressão é aplicada, o líquido flui da câmara superior para a inferior em cascata.Deve-se notar que as câmaras em cascata podem ser preenchidas com produtos químicos úmidos ou secos, como pós liofilizados.No experimento da Fig. 3a (i), a tinta vermelha da câmara superior flui junto com o corante azul em pó (sulfato de cobre) para a segunda câmara e fica azul escuro quando atinge a câmara inferior.Também mostra a pressão de controle do fluido que está sendo bombeado.Da mesma forma, quando uma alavanca é conectada a duas câmaras, passa a ser o modo de injeção simultânea, conforme mostrado na fig.3a(ii), em que o líquido pode ser distribuído uniformemente por duas ou mais câmaras quando é aplicada pressão.Como a pressão crítica depende do comprimento da alavanca, o comprimento da alavanca pode ser ajustado para obter um padrão de injeção sequencial conforme mostrado na fig.3a(iii).Uma alavanca longa (com pressão crítica Pc_long) foi conectada à câmara B e uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short > Pc_long) foi conectada à câmara A. Conforme a pressão P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) foi aplicada, apenas o líquido em vermelho pode fluir para a câmara B e quando a pressão foi aumentada para P2 (> Pc_short), o líquido azul pode fluir para a câmara A. Este modo de injeção sequencial se aplica a diferentes líquidos transferidos para suas câmaras relacionadas em sequência, o que é crítico para um POCT bem-sucedido dispositivo.Uma alavanca longa (com pressão crítica Pc_long) foi conectada à câmara B e uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short > Pc_long) foi conectada à câmara A. Conforme a pressão P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) foi aplicada, apenas o líquido em vermelho pode fluir para a câmara B e quando a pressão foi aumentada para P2 (> Pc_short), o líquido azul pode fluir para a câmara A. Este modo de injeção sequencial se aplica a diferentes líquidos transferidos para suas câmaras relacionadas em sequência, o que é crítico para um POCT bem-sucedido dispositivo.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short > Pc_long) был соединен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может течь в камер B, и и к и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и Exы и Exы и и и и и и и и и и и и и и и и и и и иLы с примеяяяяс с зрррреяяяжжж ês жжиджкitivamente, пожж ж кзжжitivamente, по п жкжлллллth, поpido você é poct.Uma alavanca longa (com pressão crítica Pc_long) foi conectada à câmara B, e uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short > Pc_long) foi conectada à câmara A. Quando a pressão P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) é aplicada, apenas o líquido é destacado em vermelho pode fluir para a câmara B, e quando a pressão for aumentada para P2 (> Pc_short), o líquido azul pode fluir para a câmara A. Este modo de injeção sequencial é aplicado a diferentes fluidos transferidos sequencialmente para as respectivas câmaras, o que é crítico para um POCT bem-sucedido.dispositivo. A opção principal (critério de tempo Pc_long) está localizada na câmera B, e a unidade de tempo curto (período de período Pc_short > Pc_long) ен с камерой A.O braço longo (pressão crítica Pc_long) está conectado à câmara B e o braço curto (pressão crítica Pc_short > Pc_long) está conectado à câmara A.Por exemplo, P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) na câmera B pode ser colocado em uma posição próxima, e por um dia útil para P2 (> Pc_short) na câmera A pode ser exibida automaticamente.Quando a pressão P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) é aplicada, apenas o líquido vermelho pode entrar na câmara B, e quando a pressão é aumentada para P2 (> Pc_short), o líquido azul pode entrar na câmara A. Este modo de injeção sequencial é adequado para transferência sequencial de vários fluidos nas respectivas câmaras, o que é crítico para o bom funcionamento do dispositivo POCT.A Figura 3a (iv) demonstra o modo de injeção seletiva, onde a câmara principal possuía uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short) e uma longa (com pressão crítica Pc_long < Pc_short) que foram conectadas à câmara A e à câmara B, respectivamente, além para outro canal de ar conectado à câmara B. Para transferir o líquido para a câmara A primeiro, as pressões P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) e P2 (P2 > P1) com P1 + P2 > Pc_short foram aplicadas ao dispositivo ao mesmo tempo.A Figura 3a (iv) demonstra o modo de injeção seletiva, onde a câmara principal possuía uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short) e uma longa (com pressão crítica Pc_long < Pc_short) que foram conectadas à câmara A e à câmara B, respectivamente, além para outro canal de ar conectado à câmara B. Para transferir o líquido para a câmara A primeiro, as pressões P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) e P2 (P2 > P1) com P1 + P2 > Pc_short foram aplicadas ao dispositivo ao mesmo tempo.Na fig.3a(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и длинный рычаг (na versão crítica Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A e камерой B соответственно.3a (iv) mostra o modo de injeção seletiva, no qual a câmara principal possuía uma alavanca curta (com pressão crítica Pc_short) e uma longa (com pressão crítica Pc_long < Pc_short), que foram adicionalmente conectadas à câmara A e à câmara B, respectivamente.к другому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A, к устройству одноврем енно прикладывали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) e P2 (P2 > P1), ou P1 + P2 > Pc_short.para outro canal de ar conectado à câmara B. Para primeiro transferir o fluido para a câmara A, as pressões P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) e P2 (P2 > P1) foram aplicadas simultaneamente ao dispositivo, onde P1 + P2 > Pc_short. 3a(iv) показан режим селективного впрыска, когда основная камера имеет короткий стержень (com a chave do Pc_short) и д линный стержень (соединенные с камерой A e камерой B соответственно, и в дополнение к no canal de entrada, подключенному к комнате B.3a(iv) mostra o modo de injeção seletiva quando a câmara principal possui uma haste curta (pressão crítica Pc_short) e uma haste longa (pressão crítica Pc_long < Pc_short) conectadas à câmara A e à câmara B respectivamente, e além de outra passagem de ar, conectado ao quarto B.Assim, P2 evita que o líquido entre na câmara B;entretanto, a pressão total P1 + P2 excedeu a pressão crítica para acionar a alavanca mais curta conectada à câmara A para permitir o fluxo do líquido para a câmara A. Então, quando a câmara B foi preenchida, basta aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) na câmara principal para ativar a alavanca longa e permitir que o líquido flua para a câmara B. Pode-se observar claramente do tempo t = 3 s a 9 s que o líquido na câmara A permaneceu constante enquanto aumentava na câmara B quando a pressão P1 foi aplicada.entretanto, a pressão total P1 + P2 excedeu a pressão crítica para acionar a alavanca mais curta conectada à câmara A para permitir o fluxo do líquido para a câmara A. Então, quando a câmara B foi preenchida, basta aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) na câmara principal para ativar a alavanca longa e permitir que o líquido flua para a câmara B. Pode-se observar claramente do tempo t = 3 s a 9 s que o líquido na câmara A permaneceu constante enquanto aumentava na câmara B quando a pressão P1 foi aplicada.Mais tarde, a ativação do P1 + P2 fornece um período de tempo crítico, a ativação do botão é maior, ный с камерой A, чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно como P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) em sua câmera, essas atividades estão ativadas e você pode definir a configuração da câmera B. то в период с t = 3 с до 9 с жидкость в камере Um оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась.Enquanto isso, a pressão total P1 + P2 excedeu a pressão crítica para ativar uma alavanca mais curta conectada à câmara A para permitir que o líquido flua para a câmara A. Então, quando a câmara B precisar ser preenchida, só precisamos aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) na câmara principal para ativar a alavanca longa e deixar o líquido fluir para a câmara B. Pode-se observar claramente que entre t = 3 s e 9 s o líquido na câmara A permaneceu constante, enquanto na câmara aumentou.B quando a pressão P1 é aplicada.Ao mesmo tempo, a pressão total P1 + P2 excede a pressão crítica, acionando a alavanca mais curta que conecta a câmara A, permitindo que o fluido flua para a câmara A.Na hora de encher a câmara A, basta aplicar P1 na câmara principal e P2 na câmara secundária.Desta forma, o comportamento do fluxo pode ser alternado seletivamente entre as câmeras A e B. O comportamento do fluxo dos quatro modos de distribuição multifuncionais pode ser encontrado no filme suplementar S2.
a Ilustração de atribuição multifuncional, ou seja, (i) atribuição em cascata, (ii) simultânea, (iii) sequencial e (iv) seletiva.As curvas representam o fluxo de trabalho e os parâmetros desses quatro modos de distribuição.b Resultados de testes de armazenamento de longo prazo em água desionizada e etanol.n = 5 experimentos independentes foram realizados e os dados são mostrados como ± dp c.Demonstrações de testes de estabilidade quando o dispositivo FAST e o dispositivo de válvula capilar (CV) estavam em (i) estados estáticos e (ii) vibratórios.(iii) Volume versus tempo para dispositivos FAST e CV em várias frequências angulares.d Publicação de resultados de testes sob demanda para (i) dispositivo FAST e (ii) dispositivo CV.(iii) Relação entre volume e tempo para dispositivos FAST e CV utilizando modo de pressão intermitente.Todas as barras de escala, 1 cm.Os dados brutos são fornecidos como arquivos de dados brutos.
O armazenamento de reagentes a longo prazo é outra característica importante de um dispositivo POCT bem-sucedido, que permitirá que pessoal não treinado manuseie vários reagentes.Embora muitas tecnologias tenham demonstrado seu potencial para armazenamento de longo prazo (por exemplo, 35 microdispensadores, 48 blisters e 49 sticks), é necessário um compartimento de recebimento dedicado para acomodar a embalagem, o que aumenta o custo e a complexidade;além disso, estes mecanismos de armazenamento não permitem a distribuição a pedido e resultam no desperdício de reagentes devido a sobras na embalagem.A capacidade de armazenamento a longo prazo foi verificada através da realização de um teste de vida acelerado utilizando material PMMA usinado em CNC devido à sua leve rugosidade e resistência à permeação de gás (Figura Suplementar S5).O aparato de teste foi preenchido com água deionizada (água deionizada) e etanol 70% (simulando reagentes voláteis) a 65°C por 9 dias.Tanto a água deionizada quanto o etanol foram armazenados usando papel alumínio para bloquear o acesso superior.A equação de Arrhenius e a energia de ativação de penetração relatadas na literatura50,51 foram utilizadas para calcular o equivalente em tempo real.Na fig.3b mostra os resultados médios de perda de peso para 5 amostras armazenadas a 65°C por 9 dias, equivalente a 0,30% para água deionizada e 0,72% para etanol a 70% durante 2 anos a 23°C.
Na fig.3c mostra o teste de vibração.Como a válvula capilar (CV) é o método de manuseio de fluidos mais popular entre os dispositivos POCT28,29 existentes, um dispositivo CV de 300 µm de largura e 200 µm de profundidade foi utilizado para comparação.Pode-se observar que quando ambos os dispositivos permanecem estacionários, o fluido na plataforma FAST-POCT veda e o fluido no dispositivo CV trava devido à expansão repentina do canal, o que reduz as forças capilares.No entanto, à medida que a frequência angular do vibrador orbital aumenta, o fluido na plataforma FAST-POCT permanece selado, mas o fluido no dispositivo CV flui para a câmara inferior (ver também Filme Suplementar S3).Isto sugere que as dobradiças deformáveis da plataforma FAST-POCT podem aplicar uma forte força mecânica ao módulo para fechar hermeticamente o líquido na câmara.No entanto, em dispositivos CV, o líquido é retido devido ao equilíbrio entre as fases sólida, aérea e líquida, criando instabilidade, e as vibrações podem perturbar o equilíbrio e causar um comportamento inesperado do fluxo.A vantagem da plataforma FAST-POCT é que ela fornece funcionalidade confiável e evita falhas na presença de vibrações que normalmente ocorrem durante a entrega e operação.
Outra característica importante da plataforma FAST-POCT é o seu lançamento sob demanda, que é um requisito fundamental para análises quantitativas.Na fig.3d compara o lançamento sob demanda da plataforma FAST-POCT e do dispositivo CV.Da fig.3d (iii) vemos que o dispositivo FAST responde rapidamente ao sinal de pressão.Quando a pressão foi aplicada à plataforma FAST-POCT, o fluido fluiu, quando a pressão foi liberada, o fluxo parou imediatamente (Fig. 3d (i)).Essa ação pode ser explicada pelo rápido retorno elástico da dobradiça, que pressiona a alavanca contra o bloco, fechando a câmara.No entanto, o fluido continuou a fluir no dispositivo CV, resultando eventualmente em um volume de fluido inesperado de aproximadamente 100 µl após a liberação da pressão (Figura 3d (ii) e Filme Suplementar S4).Isto pode ser explicado pelo desaparecimento do efeito de fixação capilar após umedecimento completo do CV após a primeira injeção.
A capacidade de manusear líquidos de molhabilidade e viscosidade variadas no mesmo dispositivo continua sendo um desafio para aplicações POCT.A baixa molhabilidade pode levar a vazamentos ou outro comportamento de fluxo inesperado nos canais, e equipamentos auxiliares, como misturadores de vórtice, centrífugas e filtros, são frequentemente necessários para preparar líquidos altamente viscosos 52 .Testamos a relação entre pressão crítica e propriedades do fluido (com uma ampla faixa de molhabilidade e viscosidade).Os resultados são mostrados na Tabela 1 e no Vídeo S5.Pode-se observar que líquidos de diferentes molhabilidade e viscosidade podem ser vedados na câmara, e quando aplicada pressão, mesmo líquidos com viscosidade de até 5500 cP podem ser transferidos para a câmara adjacente, possibilitando a detecção de amostras com alta viscosidade (ou seja, expectoração, uma amostra muito viscosa utilizada para o diagnóstico de doenças respiratórias).
Ao combinar os dispositivos de distribuição multifuncionais acima, uma ampla gama de dispositivos POCT baseados em FAST pode ser desenvolvida.Um exemplo é mostrado na Figura 1. A planta contém uma câmara de pré-armazenamento, uma câmara de mistura, uma câmara de reação e uma câmara de resíduos.Os reagentes podem ser armazenados na câmara de pré-armazenamento por longos períodos de tempo e depois descarregados na câmara de mistura.Com a pressão correta, os reagentes misturados podem ser transferidos seletivamente para uma câmara de resíduos ou para uma câmara de reação.
Como a detecção por PCR é o padrão ouro para detecção de patógenos como H1N1 e COVID-19 e envolve múltiplas etapas de reação, usamos a plataforma FAST-POCT para detecção de PCR como aplicação.Na fig.A Figura 4 mostra o processo de teste PCR utilizando a plataforma FAST-POCT.Primeiro, o reagente de eluição, o reagente de microesferas magnéticas, a solução de lavagem A e a solução de lavagem W foram pipetados para as câmaras de pré-armazenamento E, M, W1 e W2, respectivamente.Os estágios de adsorção de RNA são mostrados na fig.4a e são os seguintes: (1) quando a pressão P1 (=0,26 bar) é aplicada, a amostra move-se para a câmara M e é descarregada na câmara de mistura.(2) A pressão do ar P2 (= 0,12 bar) é fornecida através da porta A conectada ao fundo da câmara de mistura.Embora vários métodos de mistura tenham demonstrado o seu potencial na mistura de líquidos em plataformas POCT (por exemplo, mistura em serpentina 53, mistura aleatória 54 e mistura em lote 55), a sua eficiência e eficácia de mistura ainda não são satisfatórias.Ele adota o método de mistura de bolhas, no qual o ar é introduzido no fundo da câmara de mistura para criar bolhas no líquido, após o que o poderoso vórtice pode atingir a mistura completa em segundos.Experimentos de mistura de bolhas foram realizados e os resultados são apresentados na Figura Suplementar S6.Pode-se observar que quando é aplicada uma pressão de 0,10 bar, a mistura completa demora cerca de 8 segundos.Ao aumentar a pressão para 0,20 bar, a mistura completa é alcançada em cerca de 2 segundos.Os métodos para calcular a eficiência da mistura são apresentados na seção Métodos.(3) Utilize um íman de rubídio para extrair as esferas e, em seguida, pressurize P3 (= 0,17 bar) através da porta P para mover os reagentes para a câmara de resíduos.Na fig.4b,c mostra as etapas de lavagem para remover impurezas da amostra como segue: (1) A solução de lavagem A da câmara W1 é descarregada na câmara de mistura sob pressão P1.(2) Em seguida, faça o processo de mistura de bolhas.(3) A solução de lavagem A é transferida para a câmara de líquido residual e as microesferas na câmara de mistura são retiradas pelo ímã.A lavagem W (Fig. 4c) foi semelhante à lavagem A (Fig. 4b).Deve-se notar que cada etapa de lavagem A e W foi realizada duas vezes.A Figura 4d mostra as etapas de eluição para eluir o RNA das esferas;as etapas de eluição e introdução de mistura são iguais às etapas de adsorção e lavagem de RNA descritas acima.À medida que os reagentes de eluição são transferidos para a câmara de reação PCR sob pressões P3 e P4 (=0,23 bar), a pressão crítica é atingida para vedar o braço da câmara de reação PCR.Da mesma forma, a pressão P4 também ajuda a vedar a passagem para a câmara de resíduos.Assim, todos os reagentes de eluição foram distribuídos uniformemente entre as quatro câmaras de reação de PCR para iniciar as reações de PCR multiplex.O procedimento acima é apresentado no Filme Suplementar S6.
Na etapa de adsorção de RNA, a amostra é introduzida na entrada M e injetada na câmara de mistura juntamente com a solução de esferas previamente armazenada.Após misturar e remover os grânulos, os reagentes são distribuídos na câmara de resíduos.etapas de lavagem b e c, introduza vários reagentes de lavagem pré-armazenados na câmara de mistura e, após misturar e remover as esferas, transfira os reagentes para a câmara de líquido residual.d Etapa de eluição: Após a introdução dos reagentes de eluição, mistura e extração das esferas, os reagentes são transferidos para a câmara de reação PCR.As curvas mostram o fluxo de trabalho e os parâmetros relacionados das diversas etapas.Pressão é a pressão exercida através das câmaras individuais.Volume é o volume de líquido na câmara de mistura.Todas as barras de escala têm 1 cm.Os dados brutos são fornecidos como arquivos de dados brutos.
Foi realizado um procedimento de teste de PCR e a Figura Suplementar S7 apresenta perfis térmicos incluindo 20 minutos de tempo de transcrição reversa e 60 minutos de tempo de ciclagem térmica (95 e 60 ° C), sendo um ciclo térmico de 90 s (Filme Suplementar S7)..O FAST-POCT requer menos tempo para completar um ciclo térmico (90 segundos) do que o RT-PCR convencional (180 segundos para um ciclo térmico).Isto pode ser explicado pela elevada relação entre área superficial e volume e pela baixa inércia térmica da câmara de reação micro-PCR.A superfície da câmara é de 96,6 mm2 e o volume da câmara é de 25 mm3, tornando a relação superfície/volume de aproximadamente 3,86.Conforme visto na Figura Suplementar S10, a área de teste de PCR de nossa plataforma possui uma ranhura no painel traseiro, tornando o fundo da câmara de PCR com 200 µm de espessura.Uma almofada elástica termicamente condutora é fixada à superfície de aquecimento do controlador de temperatura, garantindo um contato firme com a parte traseira da caixa de teste.Isto reduz a inércia térmica da plataforma e melhora a eficiência de aquecimento/resfriamento.Durante o ciclo térmico, a parafina incorporada na plataforma derrete e flui para a câmara de reação PCR, atuando como selante para evitar a evaporação do reagente e a contaminação ambiental (ver Filme Suplementar S8).
Todos os processos de detecção de PCR descritos acima foram totalmente automatizados usando um instrumento FAST-POCT customizado, composto por uma unidade de controle de pressão programada, uma unidade de extração magnética, uma unidade de controle de temperatura e uma unidade de captura e processamento de sinal fluorescente.É digno de nota que usamos a plataforma FAST-POCT para isolamento de RNA e, em seguida, usamos as amostras de RNA extraídas para reações de PCR usando o sistema FAST-POCT e o sistema de PCR de mesa para comparação.Os resultados foram quase os mesmos mostrados na Figura Suplementar S8.O operador realiza uma tarefa simples: introduz a amostra na câmara M e insere a plataforma no instrumento.Os resultados dos testes quantitativos estão disponíveis em cerca de 82 minutos.Informações detalhadas sobre as ferramentas FAST-POCT podem ser encontradas na figura suplementar.C9, C10 e C11.
A gripe causada pelos vírus influenza A (IAV), B (IBV), C (ICV) e D (IDV) é um fenômeno global comum.Destes, o IAV e o IBV são responsáveis pelos casos mais graves e pelas epidemias sazonais, infectando 5-15% da população mundial, causando 3-5 milhões de casos graves e causando 290.000-650.000 mortes anualmente.Doenças respiratórias56,57.O diagnóstico precoce do IAV e IB é essencial para reduzir a morbilidade e os encargos económicos associados.Dentre as técnicas diagnósticas disponíveis, a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) é considerada a mais sensível, específica e precisa (>99%)58,59.Dentre as técnicas diagnósticas disponíveis, a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) é considerada a mais sensível, específica e precisa (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция обратной transcriptазой (ОТ-ПЦР) é muito mais rico, específico e específico (> 99%)58,59.Dentre os métodos diagnósticos disponíveis, a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) é considerada a mais sensível, específica e precisa (> 99%)58,59. Seu método de transferência diagnóstica é uma solução de transação garantida (ОТ-ПЦР) наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Dos métodos diagnósticos disponíveis, a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) é considerada a mais sensível, específica e precisa (>99%)58,59.No entanto, os métodos tradicionais de RT-PCR requerem pipetagem, mistura, distribuição e transferência repetidas de fluido, limitando a sua utilização por profissionais em ambientes com recursos limitados.Aqui, a plataforma FAST-POCT foi utilizada para detecção por PCR de IAV e IBV, respectivamente, para obter seu limite inferior de detecção (LOD).Além disso, o IAV e o IBV foram multiplexados para discriminar entre diferentes patótipos entre espécies, fornecendo uma plataforma promissora para análise genética e a capacidade de tratar a doença com precisão.
Na fig.5a mostra os resultados do teste de PCR do HAV usando 150 µl de RNA viral purificado como amostra.Na fig.5a (i) mostra que em uma concentração de HAV de 106 cópias/ml, a intensidade de fluorescência (ΔRn) pode chegar a 0,830, e quando a concentração é reduzida para 102 cópias/ml, ΔRn ainda pode chegar a 0,365, o que corresponde a um valor maior que isso. do grupo de controle negativo vazio (0,002), cerca de 100 vezes maior.Para quantificação baseada em seis experimentos independentes, uma curva de calibração linear foi gerada entre a concentração logarítmica e o limiar do ciclo (Ct) do IAV (Fig. 5a (ii)), R2 = 0,993, variando de 102-106 cópias/mL.os resultados estão de acordo com os métodos convencionais de RT-PCR.Na fig.5a(iii) mostra imagens fluorescentes dos resultados dos testes após 40 ciclos da plataforma FAST-POCT.Descobrimos que a plataforma FAST-POCT pode detectar HAV em quantidades tão baixas quanto 102 cópias/mL.No entanto, o método tradicional não possui um valor Ct de 102 cópias/mL, tornando-o um LOD de cerca de 103 cópias/mL.Nossa hipótese é que isso pode ser devido à alta eficiência da mistura de bolhas.Os experimentos de teste de PCR foram realizados em RNA de IAV purificado para avaliar vários métodos de mistura, incluindo mistura por agitação (mesmo método de mistura da operação convencional de RT-PCR), mistura de frasco (este método, 3 s a 0,12 bar) e nenhuma mistura como grupo de controle ..Os resultados podem ser encontrados na Figura Suplementar S12.Pode-se observar que em uma concentração mais alta de RNA (106 cópias/mL), os valores de Ct dos diferentes métodos de mistura são quase os mesmos da mistura de bolhas.Quando a concentração de RNA caiu para 102 cópias/mL, a mistura agitada e os controles não tinham valores de Ct, enquanto o método de mistura de bolhas ainda deu um valor de Ct de 36,9, que estava abaixo do limite de Ct de 38. Os resultados mostram uma característica de mistura dominante. vesículas, o que também foi demonstrado em outra literatura, o que também pode explicar porque a sensibilidade da plataforma FAST-POCT é ligeiramente superior à do RT-PCR convencional.Na fig.5b mostra os resultados da análise de PCR de amostras purificadas de RNA de IBV variando de 101 a 106 cópias/ml.Os resultados foram semelhantes ao teste IAV, atingindo R2 = 0,994 e LOD de 102 cópias/mL.
uma análise de PCR do vírus influenza A (IAV) com concentrações de IAV variando de 106 a 101 cópias/mL usando tampão TE como controle negativo (NC).(i) Curva de fluorescência em tempo real.(ii) Curva de calibração linear entre a concentração logarítmica de RNA do IAV e o limiar do ciclo (Ct) para métodos de teste FAST e convencionais.(iii) imagem fluorescente IAV FAST-POCT após 40 ciclos.b, detecção por PCR do vírus influenza B (IBV) com (i) espectro de fluorescência em tempo real.(ii) Curva de calibração linear e (iii) imagem de fluorescência FAST-POCT IBV após 40 ciclos.O limite inferior de detecção (LOD) para IAV e IBV usando a plataforma FAST-POCT foi de 102 cópias/mL, valor inferior aos métodos convencionais (103 cópias/mL).c Resultados de testes multiplex para IAV e IBV.O GAPDH foi utilizado como controle positivo e o tampão TE foi utilizado como controle negativo para evitar possível contaminação e amplificação de fundo.Podem ser distinguidos quatro tipos diferentes de amostras: (1) amostras negativas apenas para GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) infecção por IAV (“IAV+/IBV-”) com IAV e GAPDH;(3) infecção por IBV (“IAV-/IBV+”) com IBV e GAPDH;(4) Infecção por IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) com IAV, IBV e GAPDH.A linha pontilhada representa a linha limite.n = 6 experimentos biologicamente independentes foram realizados, os dados são mostrados como ± desvio padrão.Os dados brutos são apresentados como arquivos de dados brutos.
Na fig.5c mostra os resultados do teste de multiplexação para IAV/IBV.Aqui, o lisado de vírus foi usado como solução de amostra no lugar do RNA purificado, e quatro iniciadores para IAV, IBV, GAPDH (controle positivo) e tampão TE (controle negativo) foram adicionados a quatro câmaras de reação diferentes da plataforma FAST-POCT.Controles positivos e negativos são usados aqui para evitar possível contaminação e melhoria de fundo.Os testes foram divididos em quatro grupos: (1) amostras negativas para GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) infectados por IAV (“IAV+/IBV-”) versus IAV e GAPDH;(3) IBV-.infectado (“IAV-”) -/IBV+”) IBV e GAPDH;(4) infecção por IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) com IAV, IBV e GAPDH.Na fig.5c mostra que quando amostras negativas foram aplicadas, a intensidade de fluorescência ΔRn da câmara de controle positivo foi de 0,860, e o ΔRn de IAV e IBV foi semelhante ao controle negativo (0,002).Para os grupos IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ e IAV+/IBV+, as câmeras IAV/GAPDH, IBV/GAPDH e IAV/IBV/GAPDH apresentaram intensidade de fluorescência significativa, respectivamente, enquanto as demais câmeras ainda apresentaram intensidade de fluorescência em um fundo nível de 40 após o ciclo térmico.A partir dos testes acima, a plataforma FAST-POCT mostrou excelente especificidade e nos permitiu patotipar simultaneamente diferentes vírus influenza.
Para validar a aplicabilidade clínica do FAST-POCT, testamos 36 amostras clínicas (esfregaços nasais) de pacientes com IB (n = 18) e controles não-IB (n = 18) (Figura 6a).As informações do paciente são apresentadas na Tabela Suplementar 3. O status da infecção por IB foi confirmado de forma independente e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Cada amostra de pacientes foi dividida em duas categorias.Um foi processado usando FAST-POCT e o outro foi processado usando um sistema de PCR de mesa (SLAN-96P, China).Ambos os ensaios utilizam os mesmos kits de purificação e detecção.Na fig.6b mostra os resultados de FAST-POCT e PCR de transcrição reversa convencional (RT-PCR).Comparamos a intensidade de fluorescência (FAST-POCT) com -log2(Ct), onde Ct é o limiar do ciclo para RT-PCR convencional.Houve boa concordância entre os dois métodos.O FAST-POCT e o RT-PCR mostraram uma forte correlação positiva com um valor de razão de Pearson (r) de 0,90 (Figura 6b).Em seguida, avaliamos a acurácia diagnóstica do FAST-POCT.Distribuições de intensidade de fluorescência (FL) para amostras positivas e negativas foram fornecidas como uma medida analítica independente (Fig. 6c).Os valores de FL foram significativamente maiores em pacientes com IB do que em controles (****P = 3,31 × 10-19; teste t bicaudal) (Fig. 6d).A seguir, foram traçadas curvas de características operacionais do receptor (ROC) do IBV.Descobrimos que a acurácia diagnóstica foi muito boa, com área sob a curva de 1 (Fig. 6e).Tenha em atenção que, devido à encomenda obrigatória de máscaras na China devido à COVID-19 a partir de 2020, não identificámos pacientes com DII, pelo que todas as amostras clínicas positivas (ou seja, amostras de esfregaço nasal) foram apenas para IBV.
Desenho de estudo clínico.Um total de 36 amostras, incluindo 18 amostras de pacientes e 18 controles não influenza, foram analisadas usando a plataforma FAST-POCT e RT-PCR convencional.b Avaliar a consistência analítica entre o FAST-POCT PCR e o RT-PCR convencional.Os resultados foram correlacionados positivamente (r de Pearson = 0,90).c Níveis de intensidade de fluorescência em 18 pacientes com IB e 18 controles.d Nos pacientes IB (+), os valores de FL foram significativamente maiores do que no grupo controle (-) (****P = 3,31 × 10-19; teste t bicaudal; n = 36).Para cada gráfico quadrado, o marcador preto no centro representa a mediana e as linhas inferior e superior da caixa representam os percentis 25 e 75, respectivamente.Os bigodes se estendem até os pontos de dados mínimo e máximo, que não são considerados valores discrepantes.e curva ROC.A linha pontilhada d representa o valor limite estimado a partir da análise ROC.A AUC para IBV é 1. Os dados brutos são fornecidos como arquivos de dados brutos.
Neste artigo apresentamos o FAST, que possui as características necessárias para um POCT ideal.As vantagens da nossa tecnologia incluem: (1) Dosagem versátil (cascata, simultânea, sequencial e seletiva), liberação sob demanda (liberação rápida e proporcional da pressão aplicada) e operação confiável (vibração a 150 graus) (2) armazenamento de longo prazo (2 anos de testes acelerados, perda de peso de cerca de 0,3%);(3) capacidade de trabalhar com líquidos com ampla faixa de molhabilidade e viscosidade (viscosidade até 5500 cP);(4) Econômico (o custo estimado do material do dispositivo FAST-POCT PCR é de aproximadamente US$ 1).Ao combinar dispensadores multifuncionais, uma plataforma integrada FAST-POCT para detecção por PCR de vírus influenza A e B foi demonstrada e aplicada.O FAST-POCT leva apenas 82 minutos.Os testes clínicos com 36 amostras de swab nasal mostraram boa concordância na intensidade de fluorescência com o RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Os testes clínicos com 36 amostras de swab nasal mostraram boa concordância na intensidade de fluorescência com o RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).Testes clínicos com 36 testes de qualidade de vida ртной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Testes clínicos com 36 amostras de swabs nasais mostraram boa concordância com a intensidade de fluorescência do RT-PCR padrão (coeficientes de Pearson > 0,9).RT-PCR Clínica clínica 36 dias úteis de nossa vida diária дартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Os testes clínicos de 36 amostras de esfregaços nasais mostraram boa concordância da intensidade de fluorescência com o RT-PCR padrão (coeficiente de Pearson > 0,9).Paralelamente a este trabalho, vários métodos bioquímicos emergentes (por exemplo, ciclagem térmica de plasma, imunoensaios livres de amplificação e ensaios de funcionalização de nanocorpos) mostraram seu potencial em POCT.No entanto, devido à falta de uma plataforma POCT totalmente integrada e robusta, estes métodos requerem inevitavelmente procedimentos de pré-processamento separados (por exemplo, isolamento de RNA44, incubação45 e lavagem46), o que complementa ainda mais o trabalho atual com estes métodos para implementar funções avançadas de POCT com os parâmetros necessários.desempenho de saída de busca na resposta.Neste trabalho, embora a bomba de ar utilizada para acionar a válvula FAST seja pequena o suficiente para ser integrada a um instrumento de bancada (Fig. S9, S10), ela ainda consome energia significativa e gera ruído.Em princípio, bombas pneumáticas de formato menor podem ser substituídas por outros meios, como o uso de força eletromagnética ou atuação digital.Outras melhorias podem incluir, por exemplo, a adaptação de kits para ensaios bioquímicos diferentes e específicos, utilizando novos métodos de detecção que não requerem sistemas de aquecimento/resfriamento, fornecendo assim uma plataforma POCT sem ferramentas para aplicações de PCR.Acreditamos que, dado que a plataforma FAST fornece uma forma de manipular líquidos, acreditamos que a tecnologia FAST proposta apresenta o potencial para criar uma plataforma comum não apenas para testes biomédicos, mas também para monitoramento ambiental, testes de qualidade de alimentos, síntese de materiais e medicamentos. ..
A coleta e o uso de amostras de esfregaços nasais humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Zhejiang (IIT20220330B).Foram coletadas 36 amostras de swab nasal, envolvendo 16 adultos < 30 anos, 7 adultos > 40 anos e 19 homens e 17 mulheres.Foram coletadas 36 amostras de swab nasal, envolvendo 16 adultos < 30 anos, 7 adultos > 40 anos e 19 homens e 17 mulheres.Você tem 36 anos de idade, no ano passado, 16 estrelas < 30 anos, 7 estrelas 40 , 19 meses e 17 anos.Trinta e seis amostras de esfregaços nasais foram coletadas de 16 adultos com menos de 30 anos de idade, 7 adultos com mais de 40 anos de idade, 19 homens e 17 mulheres.Os dados demográficos são apresentados na Tabela Suplementar 3. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes.Todos os participantes eram suspeitos de terem gripe e foram testados voluntariamente sem compensação.
A base e a tampa FAST são feitas de ácido polilático (PLA) e impressas pela impressora 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).A fita dupla face foi adquirida à Adhesives Research, Inc. Modelo 90880. A película PET com 100 µm de espessura foi adquirida à McMaster-Carr.Tanto o adesivo quanto o filme PET foram cortados usando o cortador Silhouette Cameo 2 da Silhouette America, Inc. O filme elástico é feito de material PDMS por moldagem por injeção.Primeiro, uma moldura de PET com 200 µm de espessura foi cortada usando um sistema a laser e colada a uma folha de PMMA de 3 mm de espessura usando fita adesiva dupla-face de 100 µm.O precursor de PDMS (Sylgard 184; Parte A: Parte B = 10:1, Dow Corning) foi então derramado no molde e uma vareta de vidro foi usada para remover o excesso de PDMS.Após a cura a 70°C durante 3 horas, o filme PDMS de 300 μm de espessura pode ser removido do molde.
Fotos para distribuição versátil, publicação sob demanda e desempenho confiável são tiradas com uma câmera de alta velocidade (Sony AX700 1000 fps).O agitador orbital utilizado no teste de confiabilidade foi adquirido da SCILOGEX (SCI-O180).A pressão do ar é gerada por um compressor de ar e vários reguladores de pressão digitais de precisão são usados para ajustar o valor da pressão.O processo de teste de comportamento de fluxo é o seguinte.Uma quantidade predeterminada de fluido foi injetada no dispositivo de teste e uma câmera de alta velocidade foi usada para registrar o comportamento do fluxo.Imagens estáticas foram então tiradas de vídeos do comportamento do fluxo em tempos fixos, e a área restante foi calculada usando o software Image-Pro Plus, que foi então multiplicada pela profundidade da câmera para calcular o volume.Detalhes do sistema de teste de comportamento de fluxo podem ser encontrados na Figura Suplementar S4.
Injete 50 μl de microesferas e 100 μl de água deionizada no dispositivo de mistura do frasco.Fotografias de desempenho misto foram tiradas com uma câmera de alta velocidade a cada 0,1 segundos a pressões de 0,1 bar, 0,15 bar e 0,2 bar.As informações de pixel durante o processo de mesclagem podem ser obtidas dessas imagens usando um software de processamento de fotos (Photoshop CS6).E a eficiência da mistura pode ser alcançada com a seguinte Equação 53.
onde M é a eficiência de mistura, N é o número total de pixels da amostra e ci e \(\bar{c}\) são as concentrações normalizadas e normalizadas esperadas.A eficiência de mistura varia de 0 (0%, não misturado) a 1 (100%, totalmente misturado).Os resultados são mostrados na Figura Suplementar S6.
Kit RT-PCR em tempo real para IAV e IBV, incluindo amostras de RNA de IAV e IBV (cat. nº RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, China), tampão Tris-EDTA (tampão TE nº B541019 , Sangon Biotech, China), Positive Control RNA Purification Kit (Part No. Z-ME-0010, Liferiver, China) e Solução GAPDH (Part No. M591101, Sangon Biotech, China) estão disponíveis comercialmente.O kit de purificação de RNA inclui um tampão de ligação, lavagem A, lavagem W, eluente, microesferas magnéticas e um transportador acrílico.Os kits de RT-PCR em tempo real de IAV e IBV incluem mistura de detecção de PCR de ácido nucleico IFVA e enzima RT-PCR.Adicione 6 µl de AcrylCarrier e 20 µl de esferas magnéticas a 500 µl de solução tampão de ligação, agite bem e depois prepare a solução de esferas.Adicione 21 ml de etanol às lavagens A e W, agite bem para obter soluções das lavagens A e W, respectivamente.Em seguida, 18 µl de mistura de PCR fluorescente com ácido nucleico IFVA e 1 µl de enzima RT-PCR foram adicionados a 1 µl de solução TE, agitados e centrifugados por vários segundos, obtendo 20 µl de iniciadores IAV e IBV.
Siga o seguinte procedimento de purificação de RNA: (1) adsorção de RNA.Pipete 526 µl da solução pellet para um tubo de centrífuga de 1,5 ml e adicione 150 µl de amostra, depois agite manualmente o tubo para cima e para baixo 10 vezes.Transferir 676 µl da mistura para a coluna de afinidade e centrifugar a 1,88 x 104 g durante 60 segundos.Os drenos subsequentes são então descartados.(2) A primeira etapa da lavagem.Adicione 500 μl de solução de lavagem A à coluna de afinidade, centrifugue a 1,88 x 104 g por 40 s e descarte a solução gasta.Este processo de lavagem foi repetido duas vezes.(3) a segunda etapa da lavagem.Adicionar 500 µl de solução de lavagem W à coluna de afinidade, centrifugar a 1,88×104 g durante 15 s e descartar a solução gasta.Este processo de lavagem foi repetido duas vezes.(4) Eluição.Adicionar 200 µl de eluato à coluna de afinidade e centrifugar a 1,88 x 104 g durante 2 min.(5) RT-PCR: O eluato foi injetado em 20 μl da solução iniciadora em um tubo de PCR, depois o tubo foi colocado em um aparelho de teste de PCR em tempo real (SLAN-96P) para realizar o processo de RT-PCR.Todo o processo de detecção leva aproximadamente 140 minutos (20 minutos para purificação de RNA e 120 minutos para detecção por PCR).
526 µl de solução de esferas, 1000 µl de solução de lavagem A, 1000 µl de solução de lavagem W, 200 µl de eluato e 20 µl de solução iniciadora foram adicionados preliminarmente e armazenados nas câmaras M, W1, W2, E e câmaras de detecção de PCR.Montagem da plataforma.Em seguida, 150 µl da amostra foram pipetados para a câmara M e a plataforma FAST-POCT foi inserida no instrumento de teste mostrado na Figura Suplementar S9.Após cerca de 82 minutos, os resultados do teste estavam disponíveis.
Salvo indicação em contrário, todos os resultados dos testes são apresentados como média ± DP após um mínimo de seis réplicas utilizando apenas a plataforma FAST-POCT e amostras biologicamente independentes.Nenhum dado foi excluído da análise.Os experimentos não são aleatórios.Os pesquisadores não ficaram cegos para tarefas de grupo durante o experimento.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do Nature Research Report vinculado a este artigo.
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis em Informações Suplementares.Este artigo fornece os dados originais.
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